组织工程需要将哺乳动物细胞和生物材料精确打印在目标基底表面或者经预处理的支架上。近年来，已有几种技术可以实现该目标。其中基于喷墨和滴注的方法能以单细胞精度将活细胞进行打印，但其准确性不高且会对细胞造成损伤。另一类基于声学的细胞图案化技术可以同时对大量细胞进行高空间分辨率的打印，并保证细胞活性，但做不到选择性地操作单个细胞。目前缺少能够识别并选择单个哺乳动物细胞并在保证生存率的条件下对其进行快速准确打印的技术。

近期，慕尼黑应用科技大学激光中心的Heinz P. Huber教授团队在Advanced Functional Materials上发表了题为Single Cell Bioprinting with Ultrashort Laser Pulses的文章。该团队开发了一种基于超短近红外（NIR）激光脉冲技术的生物打印方法。该方法可以根据细胞形态或荧光从混合细胞群中选择单个细胞，并以单细胞精度和高存活率将其打印到2D目标基底或预处理过的3D支架上。

该团队首先集成了利用激光实现细胞打印的LIFT技术和倒置光学显微镜，从而实现能在水平方向上观察细胞，并以细胞形态差异或荧光从细胞群中对单个细胞进行选择（图1a）。其中激光波长为1030nm，该波长几乎不会被细胞或其他生物材料吸收，但聚焦在水溶液中可以导致光学击穿，从而形成一个迅速膨胀的气泡，并产生水凝胶射流。将该激光以3uJ、600fs的脉冲聚焦在细胞下方约70μm深度时，可以将半径约25μm范围内的一个或若干细胞从水凝胶中的细胞群中射出并打印到基底上（图1c）。

然后，该团队又将倒置显微镜换成了直立式，并在竖直平面方向上增设了一台光学显微镜，用于观察载单个细胞的水凝胶液滴的打印过程（图1b）。图2a是激光脉冲聚焦于52μm深度，在细胞被荧光标记、细胞没有被荧光标记和无细胞的条件下分别拍摄的荧光图像，整个射流过程没有抖动，可以表明该方法具有很高的重现性和鲁棒性。图2b和2c分别是聚焦脉冲具有0μm、25μm和50μm的横向偏移时从水平和竖直平面上观察到的人腱干/祖细胞（hTSPC）射流的过程。在x=0μm时细胞位于水凝胶射流的尖端，x=25μm时细胞位于水凝胶射流80%的高度处，x=50μm时细胞位于更粗且速度更慢的第二射流中，当聚焦深度更深时，第二射流会不具备足够能力将细胞送到目标基底上。

为了研究打印精度，该团队分别以50、100和200μm的间隔打印了一行人类间充质干细胞（hMSC），可见大多数细胞的偏移量小于一个细胞直径（约为14～32μm）（图3a）。为了研究打印后的细胞生存率，该团队将hTSPC打印在涂有胶原蛋白的基底上，66小时后观察到所有细胞仍有迁移行为，该试验细胞存活率100%。在15组打印人乳头状甲状腺癌细胞（TPC1）的实验中得到了98.5±0.4%的存活率，在13组打印B16F1细胞的实验中得到了96.5±0.7%的存活率，于其他采用LIFT技术的文献数据相当。图3b是依次将五个hMSC打印在交联牛血清白蛋白（BSA）支架的过程。图3c和d展示的是将GFP标记的hMSC和橙色荧光标记的TPC1从混合细胞群中分类打印到基底上。

为了证明该设备可以扩展到打印3D结构，该团队用水凝胶Pluronic F-127向目标基底打印了五层600μm×120μm的线（图3e和f）。其中水凝胶Pluronic F-127被稀释到了15wt%，并在4℃下进行打印。打印到基底上后，水凝胶恢复室温（22℃），粘度改变并最终形成稳定的结构。

综上所述，超短激光脉冲打印方法可以从混合细胞群中选择单个哺乳动物细胞，以单细胞精度和93%-99%的存活率将其打印到目标基底或经预处理的支架上。该技术目前限于人工搜索和选择细胞，打印单次耗时约20s（细胞转移时间小于100μs），结合自动化图像分析和细胞识别软件后可以实现自动化打印，大大提高可用性。由于该方法能够快速、准确、高存活率地打印细胞，可以应用于制造细胞芯片、器官芯片、三维类器官等。