克莱姆森大学开发直接3D打印微血管化生物墨水
三维（3D）生物打印为体外重建组织和器官提供了强大的平台，但往往由于打印的组织缺乏血管化而导致无法实现长期培养。过去十年，科学家们通过开发牺牲生物材料和打印技术来间接构建生物打印结构内的血管网络。但是，间接方法制造的血管网络直径通常大于100μm，使得该方法很难重构更为细微的毛细血管网络，同时打印后过程（包括去除牺牲材料和内皮化中空网络）也是复杂且耗时的。相比之下，直接生物打印可以提供一种有效的替代方法。天然生物高分子材料如纤维蛋白、胶原蛋白、明胶和脱细胞基质等，因其具有良好的生物相容性，而被广泛应用于血管化生物打印。然而，蛋白质衍生生物材料的复杂基质属性使其促血管生成特性的精细调控复杂化，并使其组成成分受到批次变化的影响。
近期，美国南卡罗来纳州克莱姆森大学生物工程系的Ying Mei教授在Biomacromolecules发表题为Engineering a Chemically Defined Hydrogel Bioink for Direct Bioprinting of Microvasculature的文章。该团队开发了一种基于海藻酸盐的水凝胶生物墨水，通过将RGD（一种用于细胞粘附的整合素结合肽）和一种带有基质金属蛋白酶可裂解连接物（MMPQK）的血管内皮生长因子（VEGF）模拟肽对藻酸盐进行修饰，可用于直接制造微血管组织结构（图1）。这种水凝胶既可以促进血管形态发生，又可以实现迁移细胞的按需隔离。
图1 应用多肽功能化生物墨水直接打印血管化组织
为了将海藻酸盐设计成一种具有生物相容性、生物可降解的生物墨水，该团队通过使用CuAAC“点击”化学介导的生物偶联技术，将具有促进血管生成和血管发育的RGDSP和MMPQK肽偶联到藻酸盐水凝胶中。内皮细胞中的整合素和血管内皮生长因子受体之间交叉激活将协同诱导血管生成信号（图2）。同时，该团队对这种多肽功能化海藻酸盐水凝胶进行了物化特性的研究。研究表明，多肽可以成功偶联到海藻酸盐上，且从三种多肽功能化海藻酸盐（RGD+MMPQK,RGD ONLY,MMPQK ONLY）的储存模量、损耗模量、水凝胶的微观结构和电镜扫描分析都得到相似的值（图3）。这些结果表明三种水凝胶具有相似的机械和微观结构特性，为随后的对比分析中研究多肽对血管形态的影响提供受控的环境。
图2 血管生成水凝胶基质设计思路
图3 多肽功能化海藻酸盐水凝胶的表征
为了研究RGD和MMPQK肽对微血管网络形成的影响，该团队将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人脂肪间充质干细胞（HADSCs）包裹在功能化的藻酸盐中培养，通过HUVEC面积、平均血管长度、连接数/mm2三个指标来量化血管形态发生。结果表明RGD+MMPQK水凝胶明显优于其他，即支持了先前的研究结果--整合素和血管内皮生长因子受体的共激活导致协同信号增强血管形态发生（图4a,b,d）。进一步，该团队发现血管网络的形成并不依赖培养基中的可溶性VEGF，而与hADSCs共培养是形成内皮索状网络所必需的(图4c)。当延长培养时间，可在水凝胶内观察到广泛的微血管形成(图4e)，三维重建证明，HUVECs已经聚集成直径约为9μm管腔网络(图4f)。
图4 多肽功能化海藻酸盐水凝胶中的血管形态发生
为了将多肽功能化水凝胶用于3D生物打印，该团队通过采用部分离子交联的方法，改善了低浓度海藻酸盐的流变特性(即屈服应力、剪切变稀和粘弹性)，以提高其可打印性。实验结果表明2%(w/v) 海藻酸盐溶液与15 mM的CaCl2部分交联为最适溶液（图5）。进一步，该团队对部分交联后的生物墨水进行基准评估。研究发现，在细胞均匀悬浮能力、细胞存活率、生物打印的重复性和准确性方面，部分交联的海藻酸盐水凝胶都有显著改善（图6）。这些结果表明，部分交联水凝胶前体方法为改善低粘度生物墨水可打印性提供了一种有效的策略。
图5 通过部分离子交联调节海藻酸盐水凝胶前体的流变性能测试
图6 部分交联RGD+MMPQK海藻酸盐生物墨水的可打印性测试
为了验证改良的生物墨水直接打印微血管组织的能力，该团队制作了VTU，一种由血管和组织特异性成分组成的异质软组织结构，以模拟软组织的基质和实质元素。该团队使用多喷嘴生物打印机，首先使用血管生成墨水打印点阵结构，然后使用第二个喷嘴打印格子空隙内的组织的“芽”（图7a）。对于组织成分，该团队使用了异于血管生成生物墨水的RGD功能化生物墨水。通过长时间共培养（7天及14天），血管成分的支柱和连接区形成了广泛的微血管网络，且RGD+MMQPK生物墨水显著促进了内皮细胞的血管特异性表型和功能。此外，该实验还发现，与均质、混合结构相比，异质、分区的组织结构中的血管形成增强（图7）。
图7 用部分交联的RGD+MMPQK生物墨水制备VTU
综上，这些结果不仅为我们的生物墨水支持血管形态发生的能力提供了证据，而且也证明了肽功能化的生物墨水用于直接制造异质微血管组织的可行性研究者所提出的VTU模块可应用于体外伤口愈合和药物毒性分析的血管化实验平台。
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