301医院郭全义团队Bioactive Materials｜生物3D打印仿生半月板
近期，301医院郭全义主任团队在Bioactive Materials期刊上发表了“3D bioprinting of a biomimetic meniscal scaffold for application in tissue engineering”的文章。301医院周建及田壮为本研究的第一作者，郭全义主任，唐佩福主任，世纪坛医院姚琦主任为本研究的共同通讯作者。
摘要：通过生物3D打印创建合适的仿生支架是治疗受损半月板的有前途的方法。然而，鉴于半月板独特的解剖结构和复杂的应力环境，许多研究已经采用了各种技术来充分利用不同材料的优势，例如结合注射或静电纺丝的打印来追逐仿生半月板，这使得该过程成为可能。在某种程度上复杂。一些研究人员仅通过生物3D打印解决了挑战，而其替代材料和模型却受到了限制。在这项研究中，基于多层仿生策略，研究者优化了半月板来源的生物墨水，甲基丙烯酸明胶（GelMA）/半月板细胞外基质（MECM）的制备，以兼顾可打印性和细胞相容性。随后，采用了具有双喷嘴+多温度打印功能的定制生物3D打印系统（上普BioMaker），以整合聚己内酯（PCL）和载有半月形纤维软骨软骨细胞（MFCs）的GelMA / MECM生物墨水的优势，从而完成了具有最佳仿生性的仿生半月板支架形态和成分方面的特征。此外，进行细胞存活力，力学，生物降解和体内组织形成以确保支架具有足够的可行性和功能性，从而为其在组织工程中的应用提供可靠的基础。
图1 半月板打印的工艺流程
生物墨水的选择
精心设计的仿生构造可为半月板组织的再生提供合适的微环境。因此，在这项研究中，研究者试图开发具有可印刷性和令人满意的细胞相容性的半月板来源的生物墨水。当前用于生物3D打印的生物墨水主要由天然聚合物组成，包括藻酸钠，明胶，胶原蛋白，壳聚糖，纤维蛋白，透明质酸和ECM 。其中，ECM保留了大多数天然成分，缺乏细胞免疫原性，是一种理想的生物材料，可以促进细胞增殖和分化。但是，由于ECM的成分复杂，它不溶于水和有机溶剂。因此，ECM很难被打印成3D结构。为了实现ECM的可打印性，由于仅MECM显示出差的胶凝性能和令人满意的形状保真度。实验中引入了明胶衍生物GelMA（上普G1）。可逆温度敏感胶凝与简单，快速的光交联结合在一起，已得到了广泛的应用。此外，它的强大的生物相容性使其成为极好的选择。因此，在这项研究中，通过将MECM与特定浓度的GelMA混合，制成了既具有可打印性又具有细胞相容性的半月板来源的生物墨水。
图2 半月板脱细胞基质材料表征
打印工艺的调节
分析生物墨水的特性对于优化打印参数至关重要。一些研究人员研究了GelMA的流变性能，并揭示了一定的稳定性和剪切稀化特性。本文研究者的研究结果充分表征了GelMA / MECM的流变学特性，表明该生物油墨具有类似的特性。此外，这项研究表明，GelMA / MECM生物墨水对温度敏感，并具有明显的延迟，需要超过30分钟才能达到稳定性。由于在打印过程中零件之间的相互热干扰，GelMA / MECM的粘弹性可能存在一些波动，这些波动可能会影响打印的平滑度和细胞的活力。因此，在这项研究中，选择了电机驱动打印而不是气动驱动打印。因此，即使GelMA / MECM由于温度波动而表现出一定的粘弹性变化，也不会明显影响打印过程的平滑性。
多喷头打印技术极大地扩展了可以选择的材料范围，这有利于构建复杂的3D模型。但是，不同喷嘴和不同材料的配合仍然涉及许多细节。因此，有必要探索每种材料的印刷条件。在载有细胞的水凝胶的印刷方面，基于生物墨水和细胞的类型存在一些差异。在这项研究中，为确保高保真度和高细胞活力（大于90％），需要反复调整包括GelMA / MECM浓度比，喷嘴的内径，打印温度和打印速度在内的各种参数。PCL的打印相对简单，唯一要点是调整打印温度和速度。这项研究中的挑战是如何很好地协调两个喷嘴和材料，以同时保证结构稳定性，细胞活力和所需的机械性能。经过反复试验，最终确定以85°C为最佳PCL打印温度，并根据凝胶动力学确定了20°C的水凝胶打印温度。打印平台温度为20°C也是绝对突出的条件，有助于防止GelMA / MECM凝胶由于交联前相对较高的室温而转变成溶液。否则，可能会破坏孔的形成。实际上，要解决整个过程中的关键问题，需要对材料和打印原理有充分的了解，并且这样的了解将允许在不同领域中顺利创建许多定制模型。
图4 生物墨水的流变学分析
图5 半月板仿生支架
细胞活性
细胞活力和机械性能是用于验证该研究模型成功的初步标准。许多因素，包括生物墨水成分以及打印模型和参数，都会影响打印过程中的细胞活力。在这项研究中，使用单喷嘴和双喷嘴印刷进行细胞活力测试，然后在体外培养1天和14天。细胞活力超过90％。此外，将水凝胶培养长达6周，细胞活力保持在90％以上。这些数据证明了该打印模型的可行性以及该研究中所用材料的良好细胞相容性。
图3 生物墨水的细胞毒性评价
图6 打印后的细胞活性
力学性能
总体而言，这项研究解决了稳定性和均匀性的问题，就机械性能而言，研究者试图增加PCL单丝间距并减小PCL单丝直径以实现更好的机械仿生。最终，PCL单丝直径设置为500μm，间距设置为1000μm。构造物的压缩模量为12.63 MPa，高于人类半月板的压缩模量（0.3–2 MPa）。此外，受积分模型的限制，拉伸模量为24.86 MPa，在径向方向上接近半月板的拉伸模量（4-20 MPa）。但是，与周向拉伸模量（78-120 MPa）相比，仍然存在很大差异。
图7 打印支架的力学性能
体内降解分析
随着荧光成像技术的发展，可以以无创方式在体内连续监测水凝胶，从而为评估水凝胶的生物降解提供了一种有效而可靠的方法。这项研究考虑了这些因素，并结合了可用技术设计了定制的生物降解研究方案。首先，研究者将印有细胞的水凝胶支架培养长达八周，以验证其基本稳定性。然后，在原位植入支架以评估PCL的生物降解，并在小鼠皮下植入Cy7标记的支架以通过体内成像监测水凝胶的降解。结果表明，支架中水凝胶的生物降解需要大约一个月的时间。分子量和纳米压痕测试的结果用于评估PCL骨架的原位降解。有关PCL结构生物降解的结果与其他研究相似。支架的分子量在3个月时没有显着差异，但在6个月时有所降低。但是，一些支架在3个月时开始出现损伤，而在6个月时仅可见这些支架的剩余部分。最初的微环境可能对支架的完整性影响很小，并且随着时间的延长和分子量的降低，支架的强度逐渐减弱，从而导致上述结果。该结果表明，半月板的机械环境可能起决定性作用。
图8 皮下水凝胶降解的定量荧光分析
结论
借助定制的双喷头+多温度控制打印系统和半月板衍生的生物墨水，本研究充分结合了PCL和GelMA / MECM / MFCs的优势，从而在形态上初步实现了与天然半月板类似的仿生支架包括形态，机械性能，成分组成和微环境。这种方法明显提高了仿生半月板支架在组织工程中的水平和效率。此外，进行了各种实验以确保支架在各种应用中的可行性和功能性。然而，该支架在某些方面仍与天然半月板不同。 PCL具有很大的硬度和不足的柔韧性。 MECM在脱细胞后失去其原始的物理性能，并且仅通过材料的逐层堆叠才能实现部分仿生，这与高度交联的半月板胶原纤维的环状排列不同。因此，材料科学和打印技术的改进可能是推动组织工程学发展的关键。当前，不同技术的结合对于实现半月板的更高水平的仿生品可能是有效的。
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