东华大学：丝素蛋白与氧化纤维素结合用于3D打印组织工程支架
蚕丝和纤维素是自然界中原料来源丰富的两种天然生物材料，在组织工程支架的研究中都发挥着重要的作用。然而，传统组织工程支架在结构仿生性方面存在许多局限性，3D打印新技术的出现，有望实现组织工程支架的个性化定制。蚕丝中的丝素蛋白（SF）主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸三种简单的氨基酸组成，具有两亲性，可形成皮升到纳升的蛋白液滴用于液滴印刷，也可通过调控其流变性能实现挤出打印。但仅仅利用RSF溶液的挤出3D打印高分辨率的支架依然存在较大困难，其原因在于：（1）SF溶液仅在浓度小于20 wt%时呈现切力变稀的特性，但是低浓度下溶液成型困难；当浓度大于20 wt%时呈现牛顿流体行为，不适于打印；（2）在挤出过程中高浓度的SF溶液会在剪切力的诱导下形成β-折叠结晶结构，导致打印头堵塞，阻碍打印线条的顺畅性。因此，无添加或少添加的SF溶液的3D打印存在巨大的挑战。纤维素材料具有较高的结晶度和刚度，是非常优异的复合材料增强填料。然而，纤维素分子内/间的大量氢键网络限制了其应用。尽管如此，纤维素分子链上大量的羟基也提供了对其进行化学修饰的可能，经过氧化处理的纤维素纳米纤维具有优异的流变性能可用于3D打印制备。
图1：实验设计原理图
东华大学纤维材料改性重点实验室张耀鹏、杨革生副研究员与上海交通大学附属第六人民医院呼吸内科任涛教授、泌尿外科宋鲁杰副主任医师合作，通过3D打印技术制备SF/氧化纳米纤维素水凝胶组织工程支架用于肺组织再生。首先利用TEMPO氧化细菌纤维素（BC），破坏BC的网络结构，制备分散性好的氧化细菌纤维素（OBC）浆料，OBC浆料具有高零切粘度、高模量、切力变稀的特点，通过OBC浆料增稠SF水溶液制备墨水进行打印，随着OBC比例提高，墨水的可打印性Pr趋近于1，墨水的可打印性、打印线条的保真度提高（图2）。复合墨水中的OBC纳米纤维在打印针头的剪切力诱导下发生沿着打印线条轴向取向排列（图3）。利用辣根过氧化物酶HRP/H2O2对SF进行交联，SF/OBC的复合水凝胶形成了类似“钢筋混凝土”结构（图1），1RSF-1OBC水凝胶的最大压缩强度达到（267.0±13.0）kPa，压缩刚度可达（325.4±14.3）kPa（30%应变），压缩应变大于50%。肺上皮干细胞在1RSF-1OBC打印支架上能够很好地粘附增殖，OBC纳米纤维能够引导干细胞沿着打印线条轴向有序生长（图4）。而且，肺上皮干细胞在1RSF-1OBC打印支架上生长1周后仍然能够维持其干性（Ki67）和上皮表型（p63），为干细胞在1RSF-1OBC打印支架上的进一步分化提供了可能。因此，3D打印的SF/OBC水凝胶支架在肺再生组织工程中展现出良好的应用前景。
图2：打印网格的数码照片：（a）2RSF-1OBC，（b）1RSF-1OBC，（c）1RSF-2OBC，（d）OBC，右上角插图是墨水相应的打印多层（>2层）结构俯视图，（e）打印线条的宽度比较，（f）半定量表征墨水可打印性（Pr），标尺：10 mm
图3：（a）打印线条的SEM图及（b）对应的2D-WAXD图中OBC[200]晶面的取向：（i）2RSF-1OBC，（ii）1RSF-1OBC，（iii）1RSF-2OBC，（iv）OBC ，标尺：500 mm, 放大图1 mm
图4：肺上皮干细胞在1RSF-1OBC支架上培养（a）3天和（b）7天增殖情况的荧光染色；（c、d、f）肺上皮干细胞在1RSF-1OBC支架上培养7天后的生长形态分布，白箭头指示打印线条长轴方向；肺上皮干细胞在1RSF-1OBC支架上培养7天后对应的（g）Ki67和（h）p63免疫荧光染色；（i）肺上皮干细胞在1RSF-1OBC水凝胶材料和TCPS上增殖情况（*p<0.05）
相关研究成果以题为3D Printed Hydrogels with Oxidized Cellulose Nanofibers and SilkFibroin for the Proliferation of Lung Epithelial Stem Cells发表在Cellulose上。东华大学博士生黄利为论文第一作者，硕士生苑炜、洪玥博士、范苏娜博士和姚响副教授为共同作者，张耀鹏教授、杨革生副研究员为共同通讯作者。
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