综述：生物3D打印肝脏体外模型进展
三维生物打印技术是一种新兴的技术，由于其能够精确控制细胞的空间分布和周围的微环境，在组织和器官构建方面具有巨大的潜力。它可以在空间上排列细胞、生物材料和生长因子，以形成类似组织的3D结构。生物3D打印可以构建复杂的异质器官，有助于解决全球器官移植短缺的危机。
肝脏是人体最大的腺体，在新陈代谢、胆汁产生、解毒、凝血、免疫、产热、调节水和电解质等500多种生化反应中起着关键作用。肝脏含有几种类型的细胞:肝细胞(HCs)、肝星状细胞(HSCs)、肝窦内皮细胞(LSECs)、Kupffer细胞(KCs)和胆汁上皮细胞(BECs)。所有这些细胞都按特定的顺序紧密排列在六边形的肝小叶中，肝小叶是肝脏的基本组成部分;每个肝脏含有半个到一百万个肝小叶。
肝腺泡是肝脏最小的功能单位。它包括两个六分之一的肝小叶。根据内部代谢产物的浓度梯度，可以将一个腺泡(图1)划分为三个区域。随着营养和氧浓度从外部(图1，区域I)到中心(图1，区域III)的降低，肝脏的再生能力和代谢率也降低。此外，肝脏有两个供血系统:(i)经门静脉来自胃肠道的静脉血和(ii)经肝动脉来自体循环的动脉血。
在过去的几十年里，肝病已经成为世界范围内的主要死亡原因之一。
根据全球健康观察的元数据，乙肝和丙肝两种肝脏相关疾病被列为全球十大疾病之一。中国约有五分之一的人患有肝病。乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、肝硬化、肝癌、酒精性肝病(ALD)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、药物性肝损伤是影响肝脏健康的主要疾病。
为了有效降低肝病的发病率和死亡率，有必要开发出疗效更好、副作用更小的药物。现有的研究方案下，新药通常是通过在二维单层细胞培养物和动物实验中开发出来的。然而，这些方法昂贵且费时。并且，二维单层细胞培养不能真实反映药物在人体内的实际代谢微环境，使用动物进行实验存在伦理问题，实验动物模型与人的代谢存在差异。
制药行业迫切需要在体外实现肝脏复杂的生理微环境，重现肝脏代谢功能的肝脏组织模型。因此，有必要开发一种体外模拟人肝脏的新技术，以使药物的开发、筛选和试验稳定，保证药物的高效低毒，推进肝脏疾病的研究。
图1 生物3D打印体外肝组织模型的构建示意图
三维生物打印肝脏组织和肝芯片分别可以更好地模拟肝脏的体内静态微环境和动态微环境。这些新兴技术可以用来操纵细胞排布组装成特定结构。克服了二维培养的局限性，能够更好地模拟了体内微环境的复杂性。
文章首先系统介绍了现有生物3D打印制造体外肝组织模型的主要技术以及可被用于打印的肝脏细胞。之后，分别从打印静态培养的肝组织与动态培养的肝芯片两个角度来阐述目前体外肝组织模型打印的研究进展。
1. 体外肝脏组织打印
生物3D打印能够精确地排布细胞，可分为挤出式、喷墨式和光固化式的打印方法。
【优势】多喷头能够构建异质多细胞体外组织，通过对喷头的精确控制，可构建复杂结构。能够克服二维细胞培养的局限性。
【局限性】生物打印分辨率与喷头及平台移动精确度有关，如今打印精度依然较低。
图2 肝脏组织三维生物打印模型的构建
除了生物材料支架包裹的细胞外，另一种无水凝胶的三维培养模型是基于细胞球状体。球状体是自组织的球形细胞聚集体。原发性造血干细胞可形成球状体来维持其表型和功能。
肝球体构造的传统方法包括悬滴法、微波阵列法和磁组装法。由于不同的表型和体外细胞培养特性，每种方法的应用细胞类型也不同，这也影响了细胞聚集形成的效果，包括球形直径和稳定性。
与基于支架的模型相比，无支架模型成本低，不需要水凝胶。然而，它们不能用来构建复杂的非均匀微观结构。
2. 肝芯片打印
肝芯片是一种基于动态微流控芯片的体外干细胞培养生物芯片模型。基于动态微流体的体外肝脏系统可以精确控制细胞培养微环境，如温度、pH值、细胞剪切应力、氧气、营养供应和废物去除。
三维生物打印技术可以应用于芯片上肝的各个制作阶段，包括芯片框架、嵌入的肝组织支架以及整个芯片的打印。
为了引出3D打印肝芯片，文章首先对传统微纳方法制备肝芯片进行了简单介绍，微纳制造光刻肝芯片，通过制造微米级流道控制液体来灌注培养芯片内部的细胞。
图3 Liver-on-chips模仿肝脏结构和功能
传统制造芯片上微流体肝的方法是光刻法和复制模塑法，两者具有时间成本与经济成本高的缺点。采用三维生物打印技术，不仅可以在更短的时间内以更低的成本构建芯片框架，而且可以在芯片上构建复杂的肝支架嵌入芯片内，用于灌注培养。
图4 3D生物打印肝脏芯片
传统药物开发方法昂贵费事且失败率高，通过构建更能模拟体内肝脏微环境的体外模型，能够作为药物开发新技术，解决器官体外再生移植供体短缺的问题。
三维生物打印肝组织支架和肝芯片是两种构建体外肝脏模型的主要技术。生物3D打印能够实现使用多种生物墨水，通过对喷头的精确控制，实现体外异质多细胞肝模型的构建。肝芯片上的微流体通道能够精确地控制液体，可以降低细胞灌注培养时的剪切应力，减小对细胞的损伤，并且多流道结构设计可以模拟肝脏的味观结构。
将3D生物打印技术应用于芯片构建肝脏，除了为筛选药物和确定肝脏疾病的分子机制提供强大的平台外，体外肝脏组织模型的开发也将变得更加高效和经济。
相关论文“Current Advances on 3D-Bioprinted Liver Tissue Models”已被Wiley旗下期刊Advanced Healthcare Materials在线刊登，浙江大学机械工程学院杨华勇院士团队生物制造方向马梁讲师为本文第一作者及通讯作者，吴钰桐硕士生为共同第一作者，其他共同通讯作者还有周竑钊博士后以及张斌副研究员。
论文链接：
https://doi.org/10.1002/adhm.202001517
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