来源： EngineeringForLife
细胞免疫治疗的出现为对抗癌症、自身免疫疾病和传染病带来了更高效的策略。然而，这些治疗相关的细胞制造过程仍然昂贵且耗时，限制了它们的应用范围。最近，受淋巴结启发的PEG-肝素水凝胶被证明能够改善实验室规模下的原始人类T细胞培养。
为了进一步推动其临床应用，来自西班牙巴塞罗那自治大学(UAB)材料研究所(ICMAB-CSIC)的Judith Guasch等团队评估了其可扩展性，并通过3D打印成功实现。因此，我们能够提高原始人类T细胞在生物混合PEG-肝素水凝胶中的浸润能力，同时增加营养、废物和气体的传输，从而在保持表型的同时提高了原始人类T细胞的增殖率。因此，本文向满足改进细胞免疫疗法中所用细胞产品制造的要求迈出了一步。相关工作以题为“3D Printing as a Strategy to Scale-Up Biohybrid Hydrogels for T Cell Manufacture”的文章发表在2024年09月16日的期刊《ACS Applied Materials & Interfaces》。
1.创新型研究内容
3D打印允许通过逐层方法自动化制造复杂结构的3D物体，这些结构具有精确设计的几何形状。在不同类型的3D打印技术中，挤出基打印在生物医学领域尤其流行，因为它简单地包括通过喷嘴挤出材料并将其以丝状形式沉积在平台上，以形成3D结构。为了在制造人工淋巴结方面向前迈出一步，并帮助克服当前与大量治疗性T细胞制造相关的ACT限制，之前描述的PEG-肝素水凝胶被分析作为3D打印的墨水，并用于人类T细胞培养（图1）。
图1 使用3D打印水凝胶进行细胞培养的自体T细胞产品制造简化方案
【PEG-肝素水凝胶作为3D打印的墨水】
为了优化营养、气体和废物交换，以最大化细胞存活率和增殖，选择了3D支架设计。该设计保持了水凝胶固有的微米级孔隙度，其有效性之前已得到证明。此外，选择了一种简单的设计，这种设计常用于评估新材料，由四层网格组成，线条间距为1.5毫米（图2A）。其简单性也有助于其转化潜力和技术转移选项。为此，PEG-肝素水凝胶被预先成型并测试作为3D打印的墨水，在室温下和不同的水凝胶形成时间进行。混合两种组分4小时后，4臂PEG硫醇和马来酰亚胺功能化的肝素样本达到了足够的粘度，可以进行打印（图2B）。然而，所得支架显示出一致性低，打印网格中的线条分化不良。为了提高其质量，预成型的水凝胶在混合后12小时使用，得到了适合本文目的的支架（图2C）。最后，本文还评估了将PEG-肝素水凝胶溶解在细胞培养基中进行潜在载细胞实验的可能性。在这种情况下，水凝胶的形成立即发生，可能是由于存在较少的二价离子，这促进了二硫键的形成，从而减少了可用于水凝胶形成的硫醇。有趣的是，所得材料可以很容易地打印（图2D）。
图2 为优化PEG-肝素水凝胶的3D打印而设计的支架示意图
【PEG-肝素印迹支架用于CD4+ T细胞扩增】
一旦证明了PEG-肝素水凝胶的可打印性，就打印并评估了3D层状结构作为初级人CD4+ T细胞培养的3D支架。作为起点，使用约35和50微克的材料，分别制造了由4层或6层组成的支架，每条线之间的间隔为1.5毫米。然后，以每毫升106个细胞的浓度，将初级人CD4+ T细胞接种在它们上面，培养6天。接着，通过流式细胞术获得了样品和对照（悬浮培养的细胞）的增殖、复制和扩增指数（32），并进行比较（见图3A–C）。
在下一步中，分析了两种类型的3D打印水凝胶在接种后5天产生的T细胞的表型。特别是，细胞被分类为初始型（TN；CD45RO-/CD62L+）、中心记忆型（TCM；CD45RO+/CD62L+）、效应型（TEFF；CD45RO-/CD62L-）和效应记忆型（TEM；CD45RO+/CD62L-）。对于四层水凝胶（图3D），观察到TCM表型的百分比显著增加，同时TEM减少。具体来说，四层打印水凝胶的TCM中位值为66%，阳性对照为61%，而阴性对照为45%。此外，打印支架的TEM平均值为23%，与阳性对照的30%和阴性对照的14%相比。最后，TN细胞从失活细胞的39%显著减少到悬浮培养或使用水凝胶培养的细胞的5%和6%，尽管激活细胞之间没有获得显著差异。尽管对于六层支架也观察到了类似的趋势，但观察到的差异不太明显，特别是对TCM表型而言（图3E）。
图3 在打印的PEG-肝素水凝胶中培养6天的初级人类CD4+ T细胞的标准化增殖结果，水凝胶高度为4层或6层，以及悬浮培养（阳性对照）
【通过3D打印技术扩大水凝胶的尺寸】
最近的研究已经证明，使用PEG-肝素水凝胶可以改善免疫细胞的培养效果，包括增殖和分化，这对于如ACT等细胞疗法来说是有趣的结果。然而，这些治疗需要培养体积可能达到升的量级，而目前的结果是在不到1毫升的体积下取得的。因此，有必要扩大水凝胶的尺寸以实现其临床应用。但是，支架尺寸的增加肯定会使细胞、营养物质和气体的传输更加困难。为了解决这个问题，本文研究了使用3D打印技术来扩大支架尺寸的方法。因此，本文选择了一个直径更大的针头（25G）并比较了其与之前的针头的可打印性。在这两种情况下，通过将预先形成的PEG-肝素水凝胶通过针头挤出并打印片段，获得了连续的纤维（图4A, B）。如本文所预期的那样，使用更大针头得到的纤维直径显著增加（图4C）。
图4 在空气中挤出的水凝胶和用27G和25G针头打印的纤维的代表图像
此外，扩散比也从1.68 ± 0.35（27G）增加到2.49 ± 0.41（25G），在两种情况下都是可以接受的，因为它们都在1到3之间。（33）此外，通过设计一个由十层组成的圆形网格结构，每层之间的线条间隔为1.5毫米，并以交替的方式垂直排列，对结构进行了修改（图5A）。这种新设计使我们能够将打印材料的数量增加10倍。为了进一步表征新设计，本文采用X射线微计算机断层扫描成像和环境扫描电子显微镜（SEM）来测量打印水凝胶的孔径和互连性（图5B, C）。正如图像所示，可以看到分层结构以及之前在大块水凝胶中观察到的水凝胶内部结构。
图5 为最大化支架尺寸而设计的3D打印水凝胶的示意图和照片图像，其直径为1厘米，以及所用材料的数量
此外，通过流变学测量了支架的机械性能（图S3），并与未打印材料进行了比较。打印水凝胶的储能模量（G′）为447 ± 34 Pa，而未打印水凝胶的储能模量为1.1 ± 0.1 kPa。如预期的那样，与大块水凝胶中的相同材料相比，打印水凝胶在打印时失去了部分硬度。然而，两种水凝胶类型的机械性能是可比的，打印的水凝胶提供了更好的细胞进入材料内部的可及性，与大块水凝胶相比，提供了更好的机会来扩大这种材料的使用规模。最后，大型3D打印水凝胶被用于培养原代人类CD4+T细胞（图6）。为了确定打印结构的优势，本文将结果与相同质量但未打印的水凝胶（大块结构）进行了比较。
图6 在播种后6天，悬浮培养的初级人类CD4+ T细胞（阳性对照）、大块非打印PEG-肝素水凝胶（10x N.P）和大块3D打印PEG-肝素水凝胶（10x 3D P）的标准化增殖结果
2.总结与展望
本文证明了PEG-肝素水凝胶可以成功进行3D打印，这为包括载细胞结构在内的众多潜在应用打开了大门。此外，与悬浮培养相比，在打印支架中孵育的原始人类CD4+ T细胞的增殖得到了增强，6层支架的增殖率高于四层支架。另外，这些3D打印的水凝胶在第5天时增加了TCM细胞的百分比，这是一种与免疫治疗高效性相关的表型。最后，生产了大型3D打印水凝胶以评估PEG-肝素实验室水凝胶的可扩展性，因此，它们作为ACT所需的免疫细胞培养用3D支架的潜在用途。在这些实验中，与最先进的悬浮方法和整体水凝胶相比，3D打印水凝胶获得了更高的增殖比率。这些结果可以通过3D打印水凝胶与整体水凝胶相比，细胞、废物、营养和气体向内部传输的增强来解释。因此，我们展示了将材料优势与3D打印技术优势相结合，可能产生在临床上有用的PEG-肝素水凝胶。
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