来源： EngineeringForLife
生物打印是构建类皮肤组织的一种很有前景的方法，因为它可以在体外将皮肤的组织结构复制到生物仿真层中。近日，来自美国维克森林大学再生医学研究所的Anthony Atala和Adam M. Jorgensen教授团队进行了多细胞生物打印体内构建类皮肤组织结构的相关研究。研究成果以“Multicellular bioprinted skin facilitates human-like skin architecture in vivo”为题于10月04日发表在《Science Translational Medicine》上。
本文使用了六种原代人类皮肤细胞进行生物打印，模拟由表皮、真皮和皮下组织构成的三层皮肤结构。将该生物打印皮肤移植到小鼠全层皮肤损伤切口上，可促进血管快速生成，并形成与人类表皮类似的结构，同时形成外观正常的细胞外基质。细胞特异性染色证实植入细胞与再生皮肤完全整合。采用类似的方法，在猪皮肤损伤模型中将5cmx5cm的生物打印自体猪皮肤移植到伤口上。结果显示生物打印皮肤移植物改善了上皮化，减少了皮肤收缩，促进正常胶原组织再生，减少纤维化。差异基因表达分析表明，在移植生物打印自体皮肤移植物的伤口中，蛋白酶可促进伤口微环境的重塑。以上结果表明，生物打印类皮肤组织可促进损伤处皮肤再生，实现非纤维化伤口愈合。该皮肤生物打印技术未来可进一步用于临床研究。
本文从以下几个方面进行详细描述
1. 含有六种原代人类皮肤细胞的生物打印类皮肤组织在体外保持三层结构并发育成熟
2. 生物打印类皮肤组织通过形成表皮屏障加速小鼠伤口闭合，促进细胞外基质重塑
3. 生物打印类皮肤组织通过形成嵌合微毛细血管促进皮肤新生血管形成
4. 生物打印类皮肤组织与再生皮肤融为一体
5. 生物打印自体皮肤组织与猪全层皮肤损伤伤口整合，上皮化增加，皮肤伤口收缩减少
6. 自体生物打印皮肤组织促进皮肤表皮和真皮层修复，并调节猪皮肤伤口中ECM重塑基因表达
图1 生物打印类人体皮肤组织流程及体外成熟
利用挤压式生物打印技术，使用人体表皮角质细胞、黑色素细胞、真皮成纤维细胞、FDPCs、真皮微血管ECs（DMECs）和脂肪细胞构建生物仿真多层皮肤结构。具体如下，细胞悬浮在三种基于纤维蛋白原的水凝胶生物墨水中，通过逐层打印形成一个3cmx3cm的三层生物仿真皮肤结构，该构建体由表皮、真皮和皮下组织组成。细胞具有正常表型，体外第7天，生物打印类皮肤组织中细胞存活率保持不变（存活细胞为77.7%±10.9），第13天和第21天，细胞存活率有所下降（存活细胞分别为58.2%±17.6和62.0%±36.9）。细胞存活率的降低与皮肤的特定区域有关，真皮下、真皮和表皮基底区域的细胞存活率增加，而真皮表层区域的细胞存活率降低。这种区域性细胞死亡称为粟粒化，表现为从18.5±3.6%（第7天）、58.5±3.9%（第13天）和70.9±10.1%（第22天）的逐渐增加。该区域还与泛细胞角蛋白免疫荧光染色阳性相关。在体外培养56天后，生物打印类皮肤组织上出现色素沉着区域。经过56天的体外成熟。表皮由角质细胞（紫色）和黑色素细胞（绿色）组成，真皮由真皮成纤维细胞（橙色）和FDPCs（红色）组成，下表皮由脂肪细胞（绿色）组成。
图2 生物打印类皮肤组织可加速伤口闭合，改善表皮屏障，促进ECM重塑
生物打印类皮肤组织体外培养4天后，移植到小鼠2.5cmx2.5cm全层皮肤损伤伤口中，跟踪观察90天。结果示：对照组包括纯生物打印凝胶组和未经处理组。数字图像和平面测量法用于监测伤口完全闭合、收缩和上皮化，早期上皮化情况有所改善。到第14天所有经生物打印类皮肤组织处理的伤口都实现完全闭合（分别为100±0.0%对64.1±5.0%、64.8±13.9%）。在整个愈合过程中，三组都表现出收缩，组间无显著差异，伤口闭合时间的差异是由于生物打印类皮肤组织处理伤口上皮化较早所致。第21天进行血红素、H&E和Masson染色证实生物打印类皮肤组织处理的伤口完全闭合。这些伤口具有上皮屏障，而对照组伤口覆盖稀疏，上皮化不完全。经生物打印类皮肤组织处理的伤口在第90天时形成类似人类的嵴线，而对照组表皮薄而平整，与正常小鼠皮肤情况一致。ECM重塑对正常愈合和纤维化愈合均至关重要。利用染色法确定再生皮肤伤口ECM结构，到第90天时可发现胶原纤维成束。使用生物打印类皮肤组织处理的伤口具有与人类皮肤最相似的纤维组织。相比之下，仅使用凝胶和未处理的伤口在第42天和第90天橙色以及红色染色增加，纤维方向平行，纤维厚度增加。定量测定胶原纤维排列系数，结果表明，生物打印类皮肤组织的胶原纤维排列系数逐渐减少，到第90天时，其排列与正常人类皮肤没有明显差异，与水凝胶和未处理对照组形成鲜明对比。胶原蛋白I和胶原蛋白III免疫荧光染色表明，经生物打印类皮肤组织处理伤口主要表现为胶原蛋白I阳性（绿色），并有一些较细的胶原蛋白III（红色）纤维染色，与正常人体皮肤相似。
图3 免疫荧光染色和RT-PCR证实，移植生物打印类皮肤组织的伤口体内90天后存在人类细胞
早期新生血管对愈合真皮的发育至关重要，可以为伤口长期恢复提供必要养分。生物打印类皮肤组织免疫荧光显示血管腔内层为CD31阳性的人类ECs（绿色），外层为CD146阳性的周细胞（红色），表明植入的人类ECs参与再生皮肤中新生血管帽的形成，并通过招募宿主周细胞而成熟。另外，小鼠皮肤、水凝胶和未处理伤口组都只显示少量CD146阳性的周细胞，而没有人CD31阳性细胞。用CD146对毛细血管进行免疫染色和H&E染色来量化90天内愈合伤口的血管再生情况。生物打印类皮肤组织处理伤口的血管密度明显高于水凝胶和未处理组（24.7±3.8、17.8±3.0、13.7±3.4），与水凝胶和未处理组相比，生物打印类皮肤组织处理伤口由更多小型（<500μm）和中型（500至1000μm）毛细血管组成。第42天时也具有类似趋势，到第90天时，所有组血管大小分布和密度都趋于正常。
图4 生物打印自体皮肤移植物促进猪皮肤伤口的非收缩性闭合
接着研究人员将该技术放大到猪皮肤损伤模型中进行进一步研究，为临床转化奠定基础。从皮肤中提取自体猪角质细胞、成纤维细胞、EC和前脂肪细胞，并在体外扩增28天。同时培养异体皮肤细胞。虽然从皮肤组织中成功获得细胞并进行扩增，但在不同治疗组和动物中，所有类型细胞的成功分离和培养并不一致。平均而言，在细胞浓度为每毫升生物墨水10×106个细胞的情况下，产生的细胞数量足以打印类皮肤组织。在28天内，平均有53.4×106个角质细胞、69.5×106个成纤维细胞、15.3×106个ECs和51.85×106个脂肪细胞。细胞包裹在以纤维蛋白原为基础的生物墨水中，生物打印出6cmx6cm的类皮肤组织。移植到5cmx5cm的全层皮肤损伤伤口上，对猪身上八个伤口位置进行随机处理，以确定特定部位愈合的差异。虽然第28天时所有组伤口都完全闭合，但生物打印类皮肤组织处理组是通过上皮化而不是收缩实现的闭合。具体来说，生物打印类皮肤组织移植的伤口闭合是通过上皮化（60.4±17.1%）完成的，而生物打印凝胶移植（44.4±10.8%）和仅水凝胶（35.0±8.4%）的伤口闭合则是通过收缩完成的，与生物打印自体移植物（35.8±10.3%）相比，生物打印同种异体移植物（48.9±6.0%）和纯水凝胶对照组（59.0±4.8%）的收缩明显较小。这些差异可能是由于对异体移植的免疫排斥造成的。
总结与展望
总之，含有多种人类皮肤细胞类型的生物打印类皮肤组织能促进小鼠全层皮肤损伤伤口愈合。生物打印猪皮肤自体移植通过再表皮化和减少皮肤收缩，加速伤口愈合。这一愈合过程导致非纤维化胶原重塑。以上研究结果表明，细胞化类皮肤组织移植物可加速伤口愈合，自体细胞进一步促进非纤维化表皮和真皮再生。生物打印自体类皮肤组织能迅速融入伤口，加速皮肤再生。皮肤生物打印技术未来可进一步用于人类皮肤损伤的治疗，加速临床转化的进展。
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